祝福

BLESSは、切断標識、ストレプトアビジン濃縮、次世代シーケンシングとも呼ばれ、ゲノム全体の二本鎖DNA損傷を検出するために使用される方法です。^{[ 1 ]} DNA修復タンパク質を標識してDNA二本鎖切断（DSB）を識別するクロマチン免疫沈降（ChIP）ベースの方法とは対照的に、BLESSはビオチン化DNAリンカーを使用してゲノムDNAをその場で直接標識し、ストレプトアビジンビーズ上のサンプルの高特異性濃縮と、それに続くヌクレオチド解像度への シーケンシングベースのDSBマッピングを可能にします。

ワークフロー

BLESSワークフロー。1) 二本鎖DNA切断（DSB）は、ビオチンマーカーを含む近位DNAヘアピンリンカーを使用して、その場で標識されます。2) 細胞を固定し、溶解し、プロテイナーゼで処理してゲノムDNA（gDNA）を抽出し、続いて剪断します。3) 標識および非標識のgDNA断片は、ストレプトアビジン由来のビーズを通過させます。ビオチンマーカーはストレプトアビジンに強い親和性を持つため、このビーズは標識断片を高い特異性で捕捉します。4) ストレプトアビジンビーズを通過後、非標識gDNA断片は除去され、濃縮されたビオチン標識gDNA断片が残ります。5) 遠位リンカーは自由端で標識gDNA断片に連結されます。6) I-SceIエンドヌクレアーゼは制限部位でリンカーを切断し、ビオチンからgDNA断片を解放します。7) バーコード特異的プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による濃縮断片の増幅に使用されます。 8) PCR 産物の次世代シーケンシングは、ゲノム内の DSB の単一ヌクレオチド解像度の解析に使用されます。

ビオチン化リンカー設計

ビオチン化リンカーは、一本鎖DNA切断ではなく二本鎖DNA切断を特異的に標識するヘアピン構造を形成するように設計されている。リンカーは、ライゲーション部位を標識する既知のバーコード配列と、バーコードに隣接するXhoI制限酵素認識部位を有する、平滑末端を有する。リンカーのヘアピンループはビオチン分子と共有結合しており、これにより、標識されたDNAをストレプトアビジンビーズで濃縮することができる。^{[ 1 ]}

ビオチン標識を用いると、マーカーのサイズが小さいため、DNAを切断することなく特異的に結合できます。ビオチンはストレプトアビジンに対しても高い親和性を持つため、ストレプトアビジンビーズ上でさらに高度な特異性精製を行うことができます。^{[ 2 ]}

核の精製とin situ標識

DSBの誘導後、細胞はホルムアルデヒドで固定され、溶解され、プロテアーゼで処理されて無傷の核が精製される。^{[ 1 ]}最初の固定ステップはクロマチンを安定化させ、サンプル調製中に追加のDSBが形成されるのを防ぐ。^{[ 3 ]}次に、DSBは平滑化され、 T4 DNAリガーゼの存在下でビオチン化リンカーとともにインキュベートされる。T4リガーゼは一本鎖切断を認識しないため、ビオチン化リンカーの共有結合によってDSB部位を直接標識する。^{[ 1 ]}

DNAの抽出、断片化、精製

標識されたゲノムDNAは核から抽出され、HaeIII制限酵素消化と超音波処理によって断片化されます。標識DNA断片は、ストレプトマイセス・アビジニイ（ Streptomyces avidinii）由来のビオチン結合タンパク質であるストレプトアビジン由来のビーズを用いて精製されます。ストレプトアビジンとビオチンの相互作用は強力かつ非常に特異的であるため、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ上でサンプルを精製することで、標識DNA断片を強力に濃縮することができます。^{[ 1 ] [ 2 ]}

遠位リンカーDNAの標識と消化

断片化とビオチン-ストレプトアビジンアフィニティー精製の後、捕捉されたDNAの自由端にプライマー結合部位を付加するための第2段階の標識化が行われる。第1段階の標識化と同様に、T4 DNAリガーゼを用いて、標識されていないDNA末端に遠位リンカーを付加する。遠位リンカーもXhoI制限酵素認識部位を有するが、ビオチン分子には共有結合していない。遠位リンカーが付加されると、捕捉されたDNA断片はI-SceIエンドヌクレアーゼによって消化され、ビオチン化されたリンカーと遠位リンカーの両方が切断され、DNA断片が放出される。^{[ 1 ]}

PCR増幅と配列決定

消化されたDNA鎖は、ビオチン化リンカーおよび遠位リンカーのバーコード配列に相補的なプライマーを用いてPCRで増幅されます。増幅されたDNAは、XhoI制限酵素で消化してI-SceI末端を除去し、精製された後、シーケンシングされます。BLESS解析には次世代シーケンシング法の使用が推奨されていますが、サンガーシーケンシングでも、堅牢性は劣るものの、良好な結果が得られることが確認されています。^{[ 1 ]}

計算分析

BLESSシーケンシングリードは、Instant Sequencing（iSeq）ソフトウェアスイートを用いて解析できます。^{[ 1 ]} DSB部位を検出するために、リードは参照ゲノムにボウタイ法を用いてアラインメントされ、染色体位置が決定されます。ゲノムは区間に分割され、マッピングされたリードが濃縮された区間を特定するために超幾何検定が用いられます。DSBは、処理サンプルと対照サンプルの濃縮度を比較することで特定されます。DNA損傷誘発サンプルにおいて統計的に有意な増加が認められた場合、この区間のDNAは脆弱であり、DSBが濃縮されていることを示唆します。^{[ 4 ]}

利点

1. 二本鎖DNA切断を特異的に認識するように設計されたビオチン化DNAリンカーの使用により、細胞内のリン酸化ヒストン変異体H2A.X（γH2A.X）などのネイティブタンパク質やDSBプロキシタンパク質に頼ることなく、偏りの少ない、より直接的な切断部位の調査が可能になります。^{[ 5 ]}このため、BLESSはさまざまな生物のさまざまな細胞で利用できます。
2. 同じ理由で、BLESSは化学的および物理的なDNA破壊、複製フォークの停止、テロメア末端の存在など、二本鎖切断の複数の原因に対しても敏感です。^{[ 1 ]}このため、BLESSは様々な条件での細胞解析に適しています。
3. DSB の標識付けはin situ で行われるため、機械的なせん断や化学的なサンプル処理による DNA 切断の検出における偽陽性のリスクが軽減されます。

制限事項

1. リンカー設計の特異性により、ビオチン化マーカーは、付着末端ではなく平滑末端での二本鎖 DNA 切断のみをラベルできるため、ライゲーションの効率が低下します。
2. BLISSなどの新しいブレイクーム調査法と比較すると、BLESSは分析を成功させるために大量の細胞出発材料を必要とし、サンプルの準備と処理に手間と時間がかかります。24個のサンプルを処理する場合、BLESSプロトコルでは15日間で60時間かかりますが、BLISSでは5日間で12時間かかります。^{[ 6 ]}
3. DNA抽出前に細胞を化学的に固定する必要があるため、BLESSは固定アーティファクトによるバックグラウンドノイズが高くなりやすい。しかし、厳密なカスタム最適化によりこの問題を軽減できることが示されている。^{[ 7 ]}
4. PCR コントロールがないため、BLESS は完全に定量的な方法ではなく、増幅バイアスが発生しやすく、スケーラビリティが低下します。
5. BLESS は、連続分析と比較して、ゲノム内の特定の時点での二本鎖切断を検出するのにのみ適しています。

代替方法

標識をその場で分解し、配列を決定する（BLISS）

BLISSでは、細胞または組織切片をまずカバーガラスに接着してからDSB標識します。これにより、遠心分離工程を省略できるため、サンプル調製時に混入する人工DSBの数が減少し、サンプルの損失が低減します。重要な点として、BLISSと比較して使用する出発物質の量が大幅に削減されます。もう一つの改良点は、ライブラリー調製のためのRNA配列の生成と増幅にin vitro転写法を用いることです。BLISSはPCRではなくT7バクテリオファージを介した転写を利用するため、BLESSで発生するPCR増幅バイアスによるエラーが減少します。^{[ 6 ]}

固定化BLESS（i-BLESS）

オリジナルのBLESS法の限界は、酵母細胞などの小さな細胞への適用に問題があることである。核の分離中に使用される低い遠心分離速度は小さな細胞には十分効率的ではないが、遠心分離速度を上げるとゲノムDNAが切断される可能性がある。しかし、i-BLESSでは、DSB標識の前に細胞をアガロースビーズに固定する。^{[ 8 ]}これにより、人工的なDNAの切断なしに、より高い遠心分離速度を使用することができる。DSB標識手順の残りの部分はBLESS法に従い、標識されたDNA断片はストレプトアビジン捕捉ステップの前にアガロースビーズから回収される。i-BLESS法は酵母に限定されず、理論的にはすべての細胞に適用できる。

DSBキャプチャ

BLESSと同様に、DSBCaptureはビオチン化アダプターを使用してDSBをその場で標識し、ストレプトアビジンビーズを使用して標識DNA断片を分離して増幅およびシーケンシングを行います。^{[ 9 ]} BLESSでの標識は平滑末端ライゲーションに依存していますが、DSBCaptureはより効率的な付着末端ライゲーションを使用してビオチン化された修飾イルミナアダプターを結合します。さらに、DSBCaptureはBLESSと比較してPCRステップ数が少ないため、増幅バイアスが低減します。^{[ 10 ]}この方法はBLESSよりも配列多様性の高いライブラリーを生成するため、シーケンシング前に多様性を向上させるために他のライブラリーをスパイクする必要がありません。さらに、DSBCaptureは両端からシーケンシングを開始できるBLESSとは対照的に、シングルエンドシーケンシングを使用します。シングルエンドシーケンシングの結果はDSB部位の配列のみを反映するため、データ収量が向上します。^{[ 11 ]}

ガイドシーケンス

ゲノムワイドDSB同定（シーケンシングによるDSBの偏りのない同定）としても知られるGUIDE-Seqは、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（dsODN）配列を組み込むことで、生細胞中のDSB部位を標識します。^{[ 12 ]}これにより、長期間にわたってDSBを標識することが可能になり、GUIDE-Seqによって特定されたDNA損傷部位は蓄積されたDSBを反映します。一方、BLESSは、細胞を固定した際に生じた一時的なDSBのみを標識・検出します。

アプリケーション

DNAの二本鎖切断は様々な原因によって引き起こされますが、アポトーシスの過程で高頻度に観察されることが多く、ゲノム不安定性に寄与し、結果としてがん性変異を引き起こす可能性があります。^{[ 1 ] [ 13 ]}このため、BLESSのような高解像度で特異的なDSBマッピング法は、ブレイクーム調査に有用です。

DSBは、CRISPR-Cas9やTALENなどのゲノム編集技術を用いて人工的に誘導することができます。これらの技術は、ゲノム上のオフターゲット部位におけるDNAの意図しない改変につながる可能性があります。^{[ 14 ]} BLESSはDSBのヌクレオチド位置を特定できるため、オフターゲットゲノム編集が起こったかどうか、またこれらのヌクレアーゼシステムによって意図せず導入されたDSBの位置を特定するために使用できます。 ^{[ 7 ]}

参考文献

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外部リンク

• BLESSサポートウェブサイト